Producción de Aceite y Grasa por Fermentación (página 2)

Fig: Patrón típico de acumulación
lipídica para una levadura (Rhodotorula
glutinispR. gracilis), crecimiento con un medio con
alta razón de C:N ; todo esto en cultivo batch

( cuadrado negro: biomasa; Cuadrado blanco: contenido
porcentual de lípido; círculo:
NH4+ presente en el medio )

(de YOON et al., 1982).

Se aprecia que a medida que medida que disminuye la
concentración de nitrógeno, se produce una marcada
acumulación de lípidos en el cultivo ( 24 –
48 hrs ). Las células sólo empiezan a transformar
el sustrato en grasas de reserva sólo cuando la reserva de
nitrógeno en el medio se ha agotado y han terminado por lo
tanto la síntesis de proteína y por lo tanto el
crecimiento. En el caso de las levaduras, la asparigina y el
ácido aspártico
son especialmente apropiados como fuente de nitrógeno para
producir una alta producción de grasas

La acumulación de lípidos también
ha sido examinada en un cultivo continuo de 1 etapa y el perfil
de acumulación depende también de la razón
de dilución, razón de crecimiento mostrada en la
figura. Al igual que en el cultivo batch el medio tiene que estar
formulado con una alta razón de carbono:
nitrógeno, la que debe ser de 50 : 1 o mayor. El cultivo
debe tener una razón de crecimiento absoluto de mas menos
un 25 a 30 % de el máximo. Bajo estas condiciones la
concentración de nitrógeno en el medio es
virtualmente nula y entonces el organismo tiene suficiente
tiempo de
residencia dentro del quimiostato para asimilar el exceso de
carbono y convertirlo en lípidos.

La razón de producción de lípidos (
gramos / Litro-1 * hora-1 ) es usualmente
más rápida en cultivos continuos que en
batch’s únicos.

Fig: Patrón típico de acumulación
para levadura (Rhodotorula glutinis) ,creciendo en un medio
limitante de nitrógeno, en cultivo continuo

( cuadrado negro: biomasa; Círculo: contenido
porcentual % de lípidos )

La razón exacta de carbono y nitrógeno fue
elegida para que el nitrógeno limitante y el exceso de
carbono fuera metabolizado en forma de lípidos.

Aunque el más alto contenido de lípidos de
la célula 50
% peso/peso fue obtenido con una razón de 50: 1 o
superior, la razón óptima para la máxima
productividad
(gr L-1 h-1 lípidos )fue con la tasa
de 25 : 1 con glucosa y de 30 – 35 : 1 cuando fue usado
permeado de suero como sustrato con la misma levadura.

Similares resultados para describir la razón
óptima de C:N , para obtener la mejor acumulación
de lípidos , fueron investigados con Rhodotorula
glutinis.

Otra característica importante es la
acumulación de carbohidratos
en un 20 %, en células con un 50 % de lípidos,
asumibles como una condición de espera para la pronta
transformación en grasas.

Otro sistema de
cultivo: el cultivo por lote alimentado ha proveído a los
experimentadores de una forma de incrementar la densidad celular
junto con el contenido lipídico en las levaduras. Es
así como Yamauchi ( 1983) uso etanol como sustrato para la
Lypomyces starkeyi y consiguió una densidad de biomasa de
150g L-1 con un contenido de lípidos de 54 %;
Rhee ( 1986 ) alcanzó 185 gramos en base seca de
Rhodotorula glutinis por litro con un contenido de lípidos
de 43 % usando glucosa como sustrato de alimentación. En
este último caso se utilizó aire enriquecido
( 40 % de O2 + 60% de aire) para ser suministrado a
las células. Con la densidad anterior un 75 % del volumen total
correspondió a las células . En caso de no usar el
" O2 enriquecido " la densidad de células es
alcanzada con mas variedades de levaduras oleaginosas, aunque
existe la
contaminación por mohos filamentosos.

Lamentablemente los costos del aire
enriquecido, imposibilitarían la implementación
comercial; aunque hay que dejar en claro que las más altas
tasas de formación de lípidos ocurren en cultivo
por lote alimentado, que en los sistemas batch o
de cultivo continuo.

Las grasas se extraen en éter de petróleo
de la masa celular que ha sido previamente deshidratada y
precipitada con etanol o metanol.

De la especie Endomyces Vernalis se extrajeron
también pastas untables ricas en proteínas,
grasas y vitaminas, en
las que la levadura formaba una gruesa capa rica en grasas, que
podían ser procesadas directamente si el cultivo se
realizaba en un recipiente plano( procedimiento en
superficie o en "sartén " )

En cuanto a los mohos ,estudios realizados por A.Azeem;
Neelagund y Rathod , indican una presencia importantes de
ácidos grasos poliinsaturados que pueden ser acumulados en
distintas especies como : Aspergillus nidulans, Aspergillus
sydowii, Fusarium equisetti, Fusarium oxysporum.

Para comprobar esto se realizó un estudio
utilizando un modificación al medio Czapek – Dox ,
de modo de maximizar la producción para dichos
mohos

• Concentración usada para 100 ml de
  medio

Los esteres de metil que identifican a los distintos
ácidos grasos, fueron identificados a través de
técnicas cromatográficas

Los datos obtenidos
fueron analizados en base a la proporción ( porcentaje )
de ácidos grasos insaturados de los aceites microbianos,
comparándolos con los de los otros aceites
comestibles.

Los datos recogidos muestran un porcentaje interesante
de lípidos, así como un porcentaje interesante de
ácidos saturados como insaturados.

Así podemos decir que del F. Oxysporum el
más alto porcentaje de ácidos grasos saturados se
encuentran en en los ácidos miristicos y palmíticos
(C14 , C16, respectivamente ); el A. Sydowii no sólo
contiene todos los ácidos saturados que produce el moho
anterior sino que produce cantidades importantes de ácidos
C11 y C13, además en todos los microorganismos se
presentó ácido oleico ( 18:1)

Además el perfil de ácidos grasos muestra que el %
total en A. nidulans, A. sydowii, F. oxysporum y F.Equisetti es
de 78.1 , 97.4, 92.55, 83.9 respectivamente. Además de
estos respectivos totales el A.nidulans tiene un 60.5% de
ácidos saturados y 39.43 % de insaturados que fue la
única especie que obtuvo mayor cantidad de ácidos
grasos saturados; mientras que las otras especies lograron una
mayor % de ácidos grasos insaturados.

Con respecto al rendimiento de lípidos logrados
la dependencia del medio de cultivo es notable, estudios
anteriores en las mismas especies logran rendimientos de
lípidos de 9.3 – 38.7 %.

Además el perfil de ácidos grasos
obtenidos por el F. Oxysporum, es similar al aceite comestible de
palma; y un cambio de
medio a sacarosa sólo logra la interconversión
entre las cantidades de C16 y C18 obtenidas, por lo que aparenta
que la síntesis de cadenas largas de ácidos grasos
es la misma.

Además basándonos en la presencia de
ácido oleico, los aceites microbianos de A.sydowii y
F.oxysporum son similares a los del aceite de nuez

Las microalgas son una fuente biológica de
lípidos e hidrocarburos,
contienen ácidos grasos en los componentes de sus
membranas, en sus fuentes de
reserva. Los ácidos grasos e hidrocarburos tienen un alto
potencial de aplicaciones. Los aceites de las algas tienen
composiciones similares a la de los demás aceites
vegetales utilizados, y en el futuro podrían ser usados
masivamente en alimentación. Los lípidos y
ácidos grasos contenidos en las microalgas varían
acuerdo a ciertas condiciones el cultivo, en algunos casos, el
contenido lipídico puede ser incrementado por la
imposición de un régimen austero de
nitrógeno, suministrando sólo una pequeña
parte de sales nutritivas nitrogenadas ( como máximo 1 %
del medio de cultivo) u otros factores de stress celular. A
comienzos de los años 40 los estudios revelaban que , las
fracciones lipídicas llegaban a 75 – 80 % de su peso
en base seca, lo que supera por mucho a gran cantidad de especies
terrestres, por ejemplo el alga verde Chorella pyreneidosa y
algunas diatomeas ( por ejemplo Nitzchia spp. ) pueden almacenar
un máximo de 70 – 80 % y 42 % de su peso seco como
grasa respectivamente

Deficiencias de otros nutrientes, además del
nitrógeno, podrían ayudar al incremento del
contenido lipídico celular, es así como la falta de
silicon por un periodo de 14 horas logró un incremento del
60 % de lípidos .

El cambio de acumulación de carbohidratos a
lípidos ocurre muy rápido en las diatomeas, por
mecanismos que aún no están bien
clarificados

Durante las primeras etapas decrecimiento de los
cultivos de algas, estas producen un alto monto de lípidos
polares y ácidos grasos poliinsaturados como
C16 y C18 .

En la fase de crecimiento estacionario se presentan
ácidos grasos 18:1 y 16:0. En el caso de las algas verde
azuladas, la composición de lípidos y ácidos
grasos, muestra sólo pequeños cambios durante el
ciclo de crecimiento.

Pero no sólo la nutrición influyen en
la composición lipídica, sino que otros factores
como la luz incrementan
la formación de poliinsaturados C16 y
C18 , así como esfingolípidos y
fosfogliceridos en Euglena gracils y Chlorella vulgaris
respectivamente. Se ha visto además que las bajas
temperaturas incrementan la síntesis de ácidos
grasos polinsaturados C18 para Monocrysis lutheri y
también causa cambios en la composición de
Dunaliella salina

El contenido de glicerol es también influenciado
por las condiciones del cultivo, particularmente las
concentraciones de NaCl, en la figura se muestra la
relación que existe entre la concentración de NaCl,
el crecimiento de la célula y la acumulación de
glicerol en Dunaliella tertiolecta. El mayor rendimiento de
glicerol se obtuvo cuando la concentración de NaCl
alcanzó los 2M, mientras que el máximo crecimiento
ocurrió cuando se obtuvo la mas baja concentración
de NaCl

Fig: Relación entre la concentración de
NaCl y la concentración intra y extracelular de
glicerol

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Sin embargo todas estas ventajas se ven entrampadas
principalmente por 2 motivos, la necesidad de dosis
ininterrumpidas de luz, así como los problemas
organolépticos de los aceites obtenidos:

Por calentamiento con luz solar de un cultivo
análogo , podrían obtenerse en seis meses con algas
anteriormente nombradas, sobre una superficie de 500
m2, aproximadamente 100 kg de grasa. En cambio con un
cultivo de colza se obtuvieron 24 – 50 kg . Pero debido a
su sabor poco agradable no puede utilizarse la grasa bruta de las
algas en la alimentación y por otra parte es muy costosa
su purificación en comparación con la
utilización directa de las grasas vegetales. Aunque su
empleo
sería posible en situaciones críticas de
abastecimiento como ocurrió en la segunda guerra
mundial.

El principal foco de los investigadores, debido a la
necesidad de renovar las fuentes de energía fósiles
y que sean lo menos contaminantes posibles es la de obtener
biocombustibles.

Anexo: Cultivo a
escala laboratorio de
algas

La microalga verde Dunaliella tertiolecta ATCC 30929 fue
cultivada en un medio con la siguiente composición: NaCl
58.5g; MgCl2•6H2O 1.5g;
KNO3 1.0 g; MgSO4
•7H2O 0.5 g; KCl 0.2g; CaCl2
•2H2O 0.2 g; NaHCO3 43mg;
KH2PO4, 40.8 mg;
K2HPO4 0.495 g; FeCl3 solucion
1.0 ml; metalica solucion 1.0 ml. La FeCl3 solucion
consistió en (por litro): FeCl3 0.03 g; EDTA
•2Na 5.84 g. La metalica solucion consistió en
(por litro): H3BO4 0.61 g; MnCl2
•4H2O 23mg; ZnSO4
•7H2O 87mg; CuSO4
•7H2O 0.06 g;
(NH4)6Mo7O24
•4H2O 21mg; CoCl2
•5H2O 15mg; EDTA •2Na 1.89g.
El cultivo maestro es depositado en 3 L de medio a 27°C,
usando un fermentador de 5 litros (Fig. 6-3). La tasa de
aireación y la rapidez de agitación fue mantenida
constante a 1 vvm y 200 rpm, respectivamente. gas fue producido
por mezcla de CO2 con aire a una razón fija
entre 0 y 0.1 y lámparas fluorescentes son usadas para la
irradiación externa del fermentador; el grado de
irradiación que llega al recipiente del fermentador es de
10,000 1x.

Fig: Aparato fermentador de 5 Litros utilizado en el
cultivo de microalgas

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Fig: Efecto de la intensidad de la luz en un fermentador
de microalgas de 5L

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La figura muestra que el crecimiento celular se ve
determinado por la intensidad de la luz, obteniéndose
crecimiento de prácticamente el doble cuando la intensidad
de la luz es el doble ( 100000 a 5000 lx )

Con respecto CO2, el crecimiento celular
normales dentro el fermentador ocurre a concentraciones de 3 a 10
%, no obstante el crecimiento limitado ocurre a concentraciones
muy bajas alrededor de 0.03 % de CO2

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Fig: Concentración celular con diferentes
concentraciones de CO2

Anexo:
Fotografías de microorganismos productores de
lípidos

Fig:Chlorella pyreneidosa Fig:Endomyces
vernalis Fig: Nitzchia spp

CONCLUSIONES

• Dentro de los microorganismos aquellos que tienen
  mayores oportunidades de desarrollo
  están principalmente los hongos en
  general ( mohos y levaduras ) y le siguen las algas, muy por
  detrás están las bacterias que acumulan una menor
  cantidad de lípidos
• Las algas a pesar de poder
  contener un porcentaje alto de su peso en lípidos,
  sufren el problema de ser dependientes de la luminosidad para
  lograr primero su crecimiento y luego la concentración
  de material lípidico en su interior, por lo que su
  cultivo si es a gran escala, debe ser en zonas de alta
  incidencia de luz solar, además cuentan con la
  desventaja de un sabor poco agradable, que requiere de procesos
  de refinación, que encarecerían el costo
• El mecanismo por el cual se producen la
  acumulación de lípidos es el mismo en bacterias y
  hongos: las celulas se ven enfrentadas a una falta de nitrogeno
  en su medio y/ o otros nutrientes, mientras la disponibilidad
  de carbohidratos supera sus requerimientos, de esta manera la
  celula ya no puede sintetizar proteinas y por lo tanto deja de
  multiplicarse; su metabolismo
  cambia y de producir reservas de energía del tipo
  carbohidrato pasa a crear material de reserva
  lipídico.
• La producción de lípidos y
  ácidos grasos por la biotecnología es una rama incipiente, que
  todavía necesita de modificaciones de modo de poder
  competir comercialmente con la producción obtenida de
  las especies vegetales.
• La producción de lípidos microbianos,
  de ser comercializada hoy día sólo puede ser un
  complemento de las distintas alternativas que hoy se presentan
  en el mercado, a
  través de su parecido ( por composición de
  ácidos grasos, porcentajes de estos dentro del material
  lipídico), a muchos aceites vegetales, ejemplo aceite de
  nuez, palma,etc.

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 Datos del autor:

Sebastian Acuña
Verrugio